гематология и переливание крови диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор меди - pismo.netnado.ru o_O
Главная
Поиск по ключевым словам:
Похожие работы
Название работы Кол-во страниц Размер
Курбонов Каримхон Муродович Официальные оппоненты: доктор медицинских... 1 277.75kb.
Доктор биологических наук, профессор 4 1288.63kb.
Условия труда и социальные факторы в формировании здоровья женщин-работниц... 1 291.45kb.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических... 5 2457.13kb.
Диссертация на соискание ученой степени доктора социологических наук... 3 771.1kb.
Доктор экономических наук В. И. Чинаров, доктор сельскохозяйственных... 5 1598.07kb.
Отзыв официального оппонента 1 57.11kb.
Направление 510600 биология Диссертация на соискание ученой степени... 4 489.92kb.
\Знаменитые люди Дона 9 1458.97kb.
На соискание ученой степени кандидата социологических наук по специальности 22. 1 92.81kb.
Франциск Скорина 1 10.13kb.
Петр Андреевич Гринев не только герой повести, но и повествователь... 1 46.71kb.
Урок литературы «Война глазами детей» 1 78.68kb.
гематология и переливание крови диссертация на соискание ученой степени кандидата - страница №1/7



РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ НЕКОММЕРЧЕСКОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР
На правах рукописи

ЗАХАРОВА ЕЛЕНА СТАНИСЛАВОВНА

ОПТИМИЗАЦИЯ РЕЖИМОВ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ С БЛАСТНЫМ КРИЗОМ ХРОНИЧЕСКОГО МИЕЛОЛЕЙКОЗА С УЧЕТОМ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БЛАСТНЫХ КЛЕТОК

IN VITRO

14.00.29 – ГЕМАТОЛОГИЯ И ПЕРЕЛИВАНИЕ КРОВИ
диссертация на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук А.Г.Туркина

доктор медицинских наук, профессор А.Ю.Барышников

Москва 2006г.
ОГЛАВЛЕНИЕ
Содержание……………………………………………………………………….2

Список сокращений…………………………………………………...………….5

Введение…...……………………………………………………………………...6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молекулярный патогенез хронического миелолейкоза................11

1.2. Предполагаемые механизмы развития терминальной стадии хронического миелолейкоза ……………………………………...13

1.2.1. Значение мутаций гена р53………………………………...13

1.2.2. Амплификация онкогена BCR-ABL как возможный механизм развития лекарственной резистентности при хроническом миелолейкозе………………………………..17

1.2.3. Активация онкогена MYC………………………………....19

1.2.4. Клеточная резистентность, обусловленная точечными мутациями домена ABL…………………………………....19

1.2.5. Фармакокинетическая резистентность при бластном кризе хронического миелолейкоза...………………………….….20

1.3. Исследования устойчивости к цитостатическим препаратам in vitro…………....................................................................................22

1.3.1. Основные методы исследования лекарственной устойчивости in vitro…...................………………………..23

1.3.2. Прогностическая значимость исследований лекарственной устойчивости in vitro при лейкозах………….............…....27

1.3.3. Индивидуализация химиотерапии по результатам исследования лекарственной устойчивости in vitro….......27

1.3.4. Исследование лекарственных взаимодействий с помощью тестов in vitro..………………………………………….…...28

1.4 Современные подходы к терапии бластного криза хронического миелолейкоза…………………………………..………………………………...30
ГЛАВА 2. ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Характеристика больных…………………………..……………......40

2.1.1 Описание исследования…...………...………………………43

2.2. Методы исследования

2.2.1Цитохимические методы ……………………………………48

2.2.2 Иммунологические исследования………………………….48

2.2.3 Методы исследования лекарственной чувствительности бластных клеток при бластном кризе хронического миелолейкоза in vitro………..……………….......................52

2.2.4 Цитогенетические исследования……………………...........55

2.3. Статистический анализ результатов исследования……...………..55

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1.Клинико-гематологическая характеристика больных……………..57

3.2.Сравнительная характеристика цитохимического и иммунологического вариантов бластного криза хронического миелолейкоза………………………….………………………............59

3.3. Характеристика лекарственной чувствительности бластных клеток у больных с бластным кризом хронического миелолейкоза in vitro……………………………………………………………….........65

3.4. Результаты терапии больных бластным кризом хронического миелолейкоза……………………………………………………....80

3.4.1. Эффективность индукционной терапии больных бластным кризом хронического миелолейкоза с помощью иматиниб мезилата..................................................................................80

3.4.2. Анализ результатов лечения больных бластным кризом хронического миелолейкоза с помощью иматиниб мезилата…..............................................................................81

3.4.3. Анализ результатов лечения больных бластным кризом хронического миелолейкоза с помощью полихимиотерапии….............................................................85

3.5. Результаты цитогенетических исследований

3.5.1. Результаты цитогенетических исследований до начала терапии………………………………………………….......91

3.5.2. Результаты цитогенетических исследований после проведенного лечения……………………………………..93

3.6. Выживаемость

3.6.1. Выживаемость больных с лимфоидным вариантом бластного криза хронического миелолейкоза…................97

3.6.2. Выживаемость больных с нелимфоидным вариантом бластного криза хронического миелолейкоза…................99

3.7. Токсичность терапии……………………………………..….......101

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………....107

ВЫВОДЫ……………………………………………………………………....124

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………...…...125

Список сокращений

ХМЛ – хронический миелолейкоз

БК – бластный криз

ХФ – хроническая фаза

ОЛ – острый лейкоз

ФА – фаза акселерации

Pgp – Р-гликопротеин

МЛУ – множественная лекарственная устойчивость

ПХТ – полихимиотерапия

LD70 – концентрация цитостатиков in vitro, летальная для 70% опухолевых клеток

LD50 – концентрация цитостатиков in vitro, летальная для 50% опухолевых клеток

ОМЛ – острые миелоидные лейкозы

ОЛЛ – острый лимфобластный лейкоз

ЛБК ХМЛ – лимфоидный вариант БК ХМЛ

НБК ХМЛ – нелимфоидный вариант БК ХМЛ

ПКГР – полная клинико-гематологическая ремиссия

ПЦО – полный цитогенетический ответ

БЦО – большой цитогенетический ответ

ЦГО – цитогенетический ответ

АСТ – аспартаттрансаминаза

АЛТ – аланинтрансаминаза

ВГН – верхняя граница нормы

ECOG – Eastern Cooperative Oncology Group – Восточная Кооперативная Онкологическая Группа

МЦО – малый цитогенетический ответ

МКА – моноклональные антитела

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Устойчивость опухоли к действию цитостатических препаратов – одна из основных проблем в лечении гемобластозов. Хронический миелолейкоз (ХМЛ) представляет собой клональное миелопролиферативное заболевание, которое характеризуется на первых этапах относительно доброкачественным течением, однако в конечном итоге неизбежно трансформируется в злокачественный процесс – бластный криз [28, 90, 103].

В этой стадии хронического миелолейкоза происходит накопление незрелых опухолевых клеток, высоко резистентных к химиотерапии. Цитостатическое лечение бластного криза ХМЛ (БК ХМЛ) недостаточно разработано и отличается невысокой эффективностью. Так, при нелимфоидном варианте БК ХМЛ применение стандартных химиотерапевтических режимов позволяет добиться ответа лишь у 7% больных. При лимфоидном БК ХМЛ процент ответов выше - 42%. Однако, длительность терминальной стадии остается короткой и составляет в первом случае 4 месяца, во втором – 10 месяцев [170].

Результаты патогенетической терапии ХМЛ с помощью ингибиторов тирозинкиназ в терминальной стадии по данным литературы несколько лучше [55, 66, 159], однако, собственный опыт лечения больных иматиниб мезилатом нуждается в обощении.

Лекарственная устойчивость при БК ХМЛ, несомненно, является многофакторной. Методы количественного определения устойчивости к цитостатическим препаратам in vitro с помощью краткосрочного культивирования бластных клеток крови и костного мозга больных [15, 140, 142, 154] позволяют определить лекарственную резистентность независимо от ее механизма и отражают конечный эффект цитотоксичности. В культуре из опухолевых клеток возможно изучение эффективной комбинации химиотерапевтических препаратов в различных концентрациях, в том числе в сочетании с ингибиторами тирозинкиназ [138]. Эти исследования открывают путь для выбора наиболее целесообразных схем лечения, а в отдельных случаях – для индивидуализации терапии.
Цель настоящего исследования

Целью настоящего исследования является разработка оптимальных терапевтических режимов на основании анализа чувствительности опухолевых клеток больных бластным кризом хронического миелолейкоза к различным цитостатическим препаратам и ингибитору Bcr-Abl-тирозинкиназы иматиниб мезилату in vitro в зависимости от варианта бластного криза хронического миелолейкоза.


Задачи исследования

  1. Изучить иммунофенотипические и цитохимические характеристики бластных клеток больных хроническим миелолейкозом.

  2. Исследовать лекарственную устойчивость in vitro бластных клеток при бластном кризе ХМЛ в зависимости от их фенотипа к широкому спектру цитостатических препаратов и иматиниб мезилату с помощью краткосрочных культуральных методов DiSC и МТТ.

  3. Сопоставить клиническую эффективность различных режимов химиотерапии, в т.ч. «агрессивных» схем, в зависимости от профиля лекарственной резистентности in vitro.

  4. Определить частоту и длительность гематологических и цитогенетических ответов, выживаемости при монотерапии иматиниб мезилатом у больных бластным кризом хронического миелолейкоза и сопоставить с результатами химиотерапии.

5. Дать рекомендации по лечению больных бластным кризом ХМЛ в зависимости от цитохимических характеристик, иммунофенотипа и лекарственной чувствительности in vitro бластных клеток.

6. Проанализировать особенности ответа на полихимиотерапию и монотерапию иматиниб мезилатом в зависимости от варианта бластного криза ХМЛ.


Научная новизна

Впервые охарактеризована лекарственная устойчивость опухолевых клеток больных с различными вариантами бластного криза хронического миелолейкоза in vitro к широкому спектру химиотерапевтических препаратов и иматиниб мезилату. Оценена значимость культуральных исследований лекарственной резистентности при бластном кризе хронического миелолейкоза.

Впервые обобщен собственный опыт лечения больных бластным кризом хронического миелолейкоза с помощью иматиниб мезилата, сопоставлена эффективность патогенетической терапии и цитостатических схем (в т.ч. агрессивных режимов) у больных с лимфоидным и нелимфоидным вариантами заболевания на различных этапах терапии. Оценена и сопоставлена токсичность различных методов лечения.

На основании собственных исследований описаны цитогенетические аномалии, характеризующие клональную эволюцию у больных бластным кризом хронического миелолейкоза.


Научно-практическая значимость

Показана необходимость выделения вариантов заболевания с помощью цитохимического исследования и иммунофенотипирования бластов до начала лечения в каждом случае бластного криза хронического миелолейкоза.

На основе изучения лекарственной устойчивости бластных клеток больных бластным кризом хронического миелолейкоза in vitro выявлены разные профили химиочувствительности при лимфоидном и нелимфоидном вариантах заболевания и на разных этапах течения бластного криза. Получены обоснования для применения комбинаций винкристина, преднизолона, рубомицина и L-аспарагиназы цитостатических режимов терапии с иматинибом при лимфоидном варианте заболевания, поскольку выживаемость таких пациентов достверно увеличивается.

Показано, что при нелимфоидном варианте бластного криза хронического миелолейкоза достоверное увеличение общей выживаемости больных и уменьшение токсичности также достигается путем применения иматиниб мезилата и комбинации химиопрепаратов.

Таким образом, на основании лабораторных методов изучения лекарственной чувствительности бластных клеток даны практические рекомендации по применению оптимальных режимов терапии при различных вариантах бластного криза хронического миелолейкоза.
Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 147 страницах машинописного текста, иллюстрированы 21 таблицей и 14 рисунками. Указатель литературы содержит 174 библиографических источника (отечественных и иностранных авторов).

Работа осуществлялась в период с июля 1996г. по май 2002г. на базе отделения химиотерапии лейкозов и патологии эритрона (научный руководитель – проф., д.м.н. Н.Д.Хорошко) Гематологического Научного Центра Российской Академии Медицинских Наук (далее – ГНЦ РАМН, директор – академик РАМН и РАН, профессор А.И.Воробьев). Вариант БК устанавливался у всех больных до начала лечения с помощью цитохимического метода в клинико-диагностической лаборатории ГНЦ РАМН (зав.лаб. - Л.Ю.Тихонова) и в лаборатории гемоцитологии ГНЦ РАМН (зав.лаб. - профессор., д.м.н. Г.И.Козинец). Иммунологический вариант БК ХМЛ с помощью метода проточной цитометрии определялся на базе лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей (зав.лаб - профессор А.Ю.Барышников) научно-исследовательского института экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского Онкологического Научного Центра им. Н.Н.Блохина (далее - НИИ ЭДиТО РОНЦ РАМН, директор- профессор А.Ю.Барышников). Цитогенетические исследования проводились в кариологической лаборатории ГНЦ РАМН (зав.лаб. - д.м.н., профессор Е.В.Домрачева).

Для оценки лекарственной устойчивости in vitro и ее сопоставления с клиническими данными применялись метод DiSC (аббривеатура differential staining cytotoxicity) и МТТ-анализ (на основе соли тетразолия 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида – сокращенно MTT). Исследования проводились в лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО РОНЦ РАМН.

Лечение пациентов осуществлялось в отделении химиотерапии лейкозов и патологии эритрона ГНЦ РАМН.

Статистический анализ результатов исследования проводился при участии лаборатории медицинской статистики ГНЦ РАМН (зав. – к.т.н. С.М.Куликов).



ГЛАВА 1

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ПАТОГЕНЕЗ ХРОНИЧЕСКОГО МИЕЛОЛЕЙКОЗА

Хронический миелолейкоз (ХМЛ) - клональное миелопролиферативное заболевание, возникающее на уровне стволовой клетки. Специфическая для ХМЛ генетическая аномалия - филадельфийская (Ph’) хромосома образуется в результате реципрокной транслокации между длинными плечами 9-й и 22-й хромосом [103, 120]. Вследствие перестройки появляется слитный ген BCR-ABL. В опытах по трансфекции этого гена мышам показано, что BCR-ABL является специфическим онкогеном, вызывающим развитие ХМЛ [27, 51, 59, 74]. У людей, страдающих ХМЛ, онкоген BCR-ABL выявляется в 100% случаев [28].

Основной продукт гена BCR-ABL - аномальный белок с молекулярной массой 210 kDa. В отличие от нормального аналога - р145, расположенного в ядре стволовой клетки, протеин р210 локализуется в цитоплазме и обладает повышенной тирозинкиназной активностью, которая максимально выражена в ABL-регионе белка [28, 87]. В цитоплазме находятся важнейшие субстраты фосфорилирования р210: протеины, являющиеся продуктами генов суперсемейств RAS, MYC, белки адгезии. При взаимодействии р210 с этими субстратами запускается каскад реакций, ведущий к трансформации нормальной стволовой клетки в опухолевую. Нарушаются процессы адгезии и контроля пролиферации со стороны стромального микроокружения [90].

Интенсивность исследований в области молекулярной биологии и патогенеза ХМЛ значительно увеличилась после создания и начала клинического использования патогенетического препарата – ингибитора Abl-тирозинкиназы STI571.

Хроническая фаза ХМЛ характеризуется массивной экспансией клеток миелоидного ряда на всех стадиях созревания. Этому процессу способствует подавление апоптоза геном BCR-ABL в зрелых клетках и клетках-предшественниках в ответ на лишение ростовых факторов, действие цитостатических препаратов, ингибиторов синтеза белка и РНК [5, 6, 94, 100, 136]. BCR-ABL-позитивные клетки могут подвергаться апоптозу при воздействии NK- и LAK-клеток [119]. Ингибитор ABL-тирозинкиназы STI571 также способен индуцировать апоптоз опухолевых клеток при ХМЛ in vitro[42].

Развитие миелоидной экспансии в хронической фазе ХМЛ может быть обусловлено повышенным пролиферативным потенциалом BCR-ABL-позитивных клеток-предшественниц. Hochhaus A. и соавт. [78] при исследовании образцов периферической крови и костного мозга 37 больных с ХФ ХМЛ обнаружили, что 10-15% CD34-позитивных клеток и 17,5% клеток с фенотипом CD34+/CD38-находились в S/G2 фазе клеточного цикла. При других миелопролиферативных заболеваниях, не сопровождавшихся экспрессией BCR-ABL, активная пролиферация не наблюдалась. Выключение ABL-тирозинкиназы с помощью STI571 приводило к полному прекращению пролиферации стволовых клеток крови у всех пациентов, а в костном мозге - у 5 из 19 больных. Пролиферативный уровень лейкозных клеток в хронической фазе ХМЛ оказывал значительное влияние на выживаемость больных [135].

В хронической фазе заболевания сохраняются стволовые клетки поликлонального Ph’-негативного гемопоэза (22). Клетки нормального Ph’-негативного гемопоэза репопулируют костный мозг в результате эффективной терапии препаратами интерферона-α [44].


1.2. ПРЕДПОЛАГАЕМЫЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ ТЕРМИНАЛЬНОЙ СТАДИИ ХМЛ

Известно, что хроническая фаза ХМЛ через 2-8 лет от момента диагностики неизбежно трансформируется в бластный криз. Молекулярные процессы, которые вызывают утрату способности клеток-предшественниц ХМЛ к дифференцировке, неизвестны. Для бластного криза (БК) ХМЛ характерна морфологическая картина острого лейкоза с постепенным исчезновением промежуточных форм. Эта стадия ХМЛ характеризуется значительной резистентностью к любым видам современной терапии. Предполагается, что в развитии БК ХМЛ играют роль определенные неслучайные события, способствующие трансформации ХМЛ в терминальную стадию. До 80% больных с БК ХМЛ имеют дополнительные хромосомные аномалии, которые могут усиливать генетическую нестабильность популяции стволовых клеток и способствовать селекции наиболее резистентных клонов [90].

Значительная лекарственная устойчивость БК ХМЛ к современным терапевтическим режимам позволяет предположить, что в ее развитии принимают участие многие факторы, способствующие развитию резистентности как на клеточном, так и на популяционном уровне. Очевидно, что специфические хромосомные изменения, влияющие на процессы трансформации в терминальную стадию, также способствуют формированию лекарственной устойчивости опухолевых клеток к широкому спектру стандартных цитостатических средств и новых селективных препаратов.
1.2.1 Значение мутаций гена р53

Ген р53, локализованный на коротком плече хромосомы 17, кодирует ядерный ДНК-связывающий фосфопротеин. Нормальный "дикий" тип белка р53 является важнейшим регулятором процессов пролиферации, апоптоза и репарации ДНК [1, 63, 88, 147]. Это многофункциональный протеин, который играет значительную роль в поддержании генетической стабильности клеток, предотвращая накопление мутаций.


Биологическое значение мутаций р53

Мутации гена р53 - частое событие при самых различных опухолях человека, что указывает на важную роль белка р53 в канцерогенезе, и в том числе и в лейкозогенезе. Основная часть мутаций затрагивает центральный регион гена, где расположены 4 консервативных домена, отвечающих за последовательное специфическое связывание ДНК [46]. Наиболее частый путь инактивации р53 - точечные мутации, в результате которых образуются дефектные протеины с заменой одной аминокислоты. [37].

В результате интенсивных фундаментальных исследований по молекулярной биологии р53 было показано, что клетки с нарушенной функцией р53 вследствие бесконтрольного деления приобретают множественные генетические повреждения, которые фиксируются в геноме и способствуют спонтанному образованию опухолей. Формирующаяся в результате значительная мутабельность может вызывать снижение фунцкии генов-супрессоров опухолевого роста и дальнейшую опухолевую прогрессию [29, 30, 46, 47].
Клиническое значение мутаций р53

При БК ХМЛ частота хромосомных перестроек, затрагивающих ген р53, выше, чем при других лейкозах. Изохромосома 17 выявляется в среднем у 15-30% больных БК ХМЛ [60, 105]. Согласно более ранним исследованиям наличие изохромосомы 17 в сочетании с филадельфийской хромосомой считалось неблагоприятным прогностическим фактором в отношении ответа на терапию и выживаемости [67].

В рамках концепции кинетической резистентности при ХМЛ генетическая нестабильность опухолевых клеток опосредуется онкогеном BCR-ABL и дополнительными мутациями р53, приводящими к бесконтрольной пролиферации [90]. Для БК ХМЛ, так же, как и для резистентных форм острых лейкозов, характерен феномен быстрого обратного роста опухоли - "regrowth resistance" [112, 113]. Предполагается, что доминирующая популяция опухолевых клеток высоко чувствительна к лечению и поэтому элиминируется, но в резидуальных бластах, находящихся в фазе G0 и переживающих лечение, происходят мутации, ведущие к формированию лекарственной устойчивости и фиксирующиеся в геноме. Пролиферативный потенциал резидуальных опухолевых клеток может повышаться вследствие инактивации р53 «дикого» типа и его респонсивных элементов - генов р21 и gadd45, контролирующих репликацию ДНК [46]. Терапия STI571 в терминальной стадии ХМЛ приводит к избирательному уничтожению чувствительных BCR-ABL-позитивных клеток, но клоны с дополнительными генетическими аномалиями могут репопулировать костный мозг, что также является следствием быстрого обратного роста опухоли.

Кластерная амплификация гена BCR-ABL и его интеграция с коротким плечом аномальной хромосомы 17 может способствовать трансформации ХМЛ в терминальную стадию [95].

Нестабильность генома отражается в появлении таких атипичных хромосомных аномалий, как трисомии хромосом 22, 13, 21, 10, 11, 14, 15, 19, 1, 4, 9, 12, 17, 18; дополнительные транслокации t(1;1) (p12;q12), t(6;8) (q16; p21), t(3;21) (q27;q22), t(17q; 18q); дупликации хромосом 1, 2 и 7; делеции хромосом 7, 11, 21, инверсии хромосом 3, 7, 9 [48]. Необходимо отметить, что указанные аберрации появлялись не как самостоятельные, а как дополнительные и сравнительно редкие находки. Наличие множественных хромосомных перестроек не уменьшало выживаемость больных по сравнению с теми пациентами, у которых обнаруживалась лишь одна дополнительная цитогенетическая аномалия. Авторы отмечают, что хромосомные аберрации достоверно чаще (р=0,04) выявляются при нелимфоидном бластном кризе ХМЛ. Полагают, что наличие клональной эволюции ухудшает прогноз в отношении выживаемости [48].

За последние 10 лет появились новые данные относительно клинических особенностей ХМЛ с изохромосомой 17. Еще в 1988г. Было отмечено, что наличие изохромосомы 17 у больных в ФА ХМЛ перед аллогенной трансплантацией не увеличивает риск развития рецидива после ТКМ [116]. Данная цитогенетическая аномалия оказалась характерной исключительно для нелимфоидного варианта БК ХМЛ и была связана с предшествующей фазой акселерации и базофилией. Медиана выживаемости пациентов с перестройками 17 хромосомы не отличалась от медианы выживаемости больных с отсутствием данной мутации [52].

Эти данные не вполне согласуются с концепцией агрессивности опухолей, несущих мутантный протеин р53. Однако, данные современной литературы позволяют сделать вывод, что клиническая значимость р53 как прогностического фактора остается неясной, и трактовать ее следует лишь в сочетании с другими показателями. Это обусловлено несовершенством методики определения экспрессии и функциональной активности протеина, отсутствием стандартов. Также требуется анализ значительно большего объема клинического материала [38, 149]. Мутации р53 могут локализоваться более чем в 100 различных кодонах, что способствует формированию определенной, не всегда одинаковой биологической активности р53. Существуют данные как о позитивных, так и негативных корреляциях между мутациями р53, апоптозом и лекарственной устойчивостью при различных гематологических нозологиях.
1.2.2. Амплификация онкогена BCR-ABL как возможный механизм развития резистентости при ХМЛ.

Нормальный ген ABL в клетке выполняет функцию гена-супрессора опухолевого роста. В активном состоянии его продукт - белок - связывается с pRb (протеином ретинобластомы), что приводит к остановке клеточного цикла. При ХМЛ вследствие делеции ген ABL утрачивает эту функцию [162, 166]. Клетки хронической фазы ХМЛ характеризуются повышенным уровнем мутаций, чему способствует нарушение контроля со стороны стромального микроокружения [90].

В случае ХМЛ инициальное онкогенное событие - формирование гена BCR-ABL - вероятнее всего обусловливает и дальнейшее прогрессирование заболевания. По мере трансформации ХМЛ в терминальную стадию наблюдается значительное уменьшение и утрата полных гематологических ремиссий и цитогенетических ответов, их длительности. В клеточных линиях показано, что по мере трансформации в терминальную стадию наблюдается спонтанная амплификация гена. Она происходит либо самостоятельно, либо за счет удвоения Ph’-хромосомы. Это подтверждается при культивировании Ph’-позитивных клеточных линий [83, 152, 157]. Приведенные выше данные свидетельствуют в пользу того факта, что ген BCR-ABL играет важнейшую роль в опухолевой прогрессии ХМЛ.

Селективная терапия STI571, выключающая функции ABL-тирозинкиназы, способна индуцировать ремиссии у больных с БК ХМЛ даже при наличии дополнительных хромосомных аномалий, хотя продолжительность ответа остается небольшой. Как правило, до начала лечения опухолевые клетки больных чувствительны к препарату на всех стадиях заболевания [41]. Однако при длительной инкубации клеточных линий с ингибитором тирозинкиназ развивается вторичная резистентность к STI571 [84, 91]. Реактивация гена BCR-ABL вследствие его амплификации в настоящее время считается одним из возможных механизмов, вызывающих у больных БК ХМЛ резистентность к STI571 [32, 124].

Были проведены эксперименты, моделирующие лекарственную устойчивость in vitro [Gambacorti-Passerini С. et al., 84]. С помощью метода FiSH выявлена четырехкратная амплификация гена BCR-ABL в клеточной линии LAMA84R, резистентной к STI571. В клеточной линии Ba/F3, позитивной по BCR-ABL и резистентной к STI571 в результате культивирования с возрастающими концентрациями препарата, обнаружена пятикратная амплификация гена BCR-ABL, повышение уровня мРНК BCR-ABL. Количество BCR-ABL-протеина возрастало более чем в 10 раз. В лекарственно-устойчивой клеточной линии БК ХМЛ К562 после инкубации с различными концентрациями STI571 не было выявлено значимой амплификации гена BCR-ABL, однако, уровень p210BCR/ABL протеина увеличился в 2-3 раза [E.Weisberg, J.D.Griffin et al., 152].

Этот факт может частично объяснить результаты терапии STI571 при БК ХМЛ, где, несмотря на высокий процент ответов, у подавляющего большинства больных развивается рецидив через 2-5 месяцев [32, 124]. Интересно, что в некоторых резистентных к STI571 клеточных линиях после его удаления из среды через 2-3 месяца амплификация гена BCR-ABL исчезала, и чувствительность к препарату восстанавливалась [124].

Двойная Ph’-хромосома - одна из трех "главных" генетических аномалий при БК ХМЛ. Она выявляется у 25-38% больных на момент диагностики БК. Этот факт является неблагоприятным прогностическим признаком в отношении достижения ответа на терапию и выживаемости [49, 67]. Наличие двойной Ph-хромосомы, особенно в сочетании с трисомией хромосомы 8, уменьшает вероятность ответа на терапию STI571 в фазе акселерации. У 30% таких больных БК ХМЛ развивается через 150 дней от начала терапии [92].
1.2.3. Активация онкогена MYC

Трисомия хромосомы 8 - наиболее часто встречающаяся дополнительная генетическая аномалия, которая обнаруживается у 29-36% больных в сочетании с Ph’-хромосомой при трансформации в терминальную стадию ХМЛ [49, 67]. Данная мутация может быть ассоциирована с гиперэкспрессией онкогена MYC, локализующегося на длинном плече хромосомы 8. Его продукты - цитоплазматические протеины - участвуют в каскаде реакций, запускаемых ABL-тирозинкиназой, что способствует клеточной пролиферации, независимой от регулирующего влияния ростовых факторов. Роль онкогена MYC в эволюции ХМЛ остается неясной, так как наряду с увеличением пролиферативного потенциала клеток экспрессия MYC активирует апоптоз, в том числе опосредуемый протеином р53 [3, 35, 88]. Однако, как уже было отмечено выше, несмотря на проапоптотическую активность MYC, обнаружение трисомии 8 одновременно с филадельфийской хромосомой у больных с БК ХМЛ значительно ухудшает прогноз[49, 67].


1.2.4. Клеточная резистентность, обусловленная точечными мутациями домена Abl

Еще один возможный механизм развития лекарственной устойчивости к STI571 – точечные мутации гена BCR-ABL в Abl-домене, приводящие к замене треонина на изолейцин в аминокислотном остатке 315, который расположен в АТФ-связывающем регионе Abl-тирозинкиназы. В результате нарушается «захват» иматиниб мезилата опухолевыми клетками [31]. Этот механизм был ведущим у 6 из 9 исследованных больных, проявивших клиническую резистентность к иматиниб мезилату [45]. Французская группа исследователей показала, что данная мутация обнаруживалась у 3 больных из 24 (16 – в ХФ и 8 - в ФА), резистентных к терапии иматиниб мезилатом, в том числе и в хронической фазе заболевания [117]. На момент диагностики ни у кого из больных не удалось обнаружить данную мутацию. Однако еще до начала лечения единичные опухолевые клетки у больных во всех стадиях ХМЛ содержали впервые выявленные новые генетические поломки, приводящие к замене фенилаланина в точке 311 на лейцин и метионина в аминокислотном остатке 351 на треонин. Более того, в процессе лечения иматиниб мезилатом с помощью ПЦР обнаружено клональное преимущество клеток, несущих вышеописанные мутации. Интересно, что при исследовании клеток 24 больных с помощью метода in situ гибридизации амплификация гена BCR-ABL не обнаруживалась.


1.2.5. Фармакокинетическая резистентность при бластном кризе хронического миелолейкоза

В связи с активным клиническим применением ингибитора Abl-тирозинкиназы на всех стадиях ХМЛ в литературе активно обсуждаются механизмы, вызывающие устойчивость опухолевых клеток к препарату, в том числе и фармакокинетические. В качестве возможного механизма развития резистентности к STI571 при БК ХМЛ обсуждается гипотеза, что кислый α1-гликопротеин (так называемый "белок острой фазы"), синтезирующийся в печени, может связывать ингибитор Abl-тирозинкиназы в плазме и таким образом снижать его эффективную концентрацию. Уровень кислого α1-гликопротеина в плазме достоверно выше у больных на всех стадиях ХМЛ, чем у здоровых доноров. Кроме того, STI571 может подвергаться биотрансформации в печени с участием системы цитохрома р450, что приводит к функциональной инактивации препарата [40, 124].



Р-гликопротеин

Р-гликопротеин (Pgp) - белок клеточной мембраны с массой 170 кД, обладающий АТФ-азной активностью и кодируемый геном MDR-1. Pgp функционирует как насос, удаляющий чужеродные вещества из клетки, и в норме экспрессируется в гематотканевых барьерах [134]. Р-гликопротеин опосредует феномен множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Клетки с фенотипом МЛУ обладают перекрестной резистентностью к целому ряду цитостатических препаратов, различных по структуре и механизму действия. Pgp выявляется на бластных клетках 30-69% больных БК ХМЛ [104]. Обнаружена корреляция экспрессии функционально активного Pgp с экспрессией антигенов, характерных для предшественников и клеток ранней миелоидной дифференцировки - CD34 и CD13 [130, 139]. Pgp кодируется геном MDR-1, расположенным на длинном плече хромосомы 7 [173]. MDR-1 - стресс-индуцируемый ген, экспрессия которого может быть увеличена при воздействии рентгеновского излучения, теплового и осмотического шока, противоопухолевых препаратов, мутаций гена р53, активирующих промотор гена MDR-1 [21, 23, 53, 54, 97, 151]. Экспрессия MDR-1 гена/протеина может возникать после экспозиции цитостатических препаратов в отсутствие пролиферации опухолевых клеток и исчезать через несколько недель после отмены индуцирующего воздействия. Этот факт позволяет предположить, что появление MDR-1 гена/протеина связано с изменением фенотипа клеток, а не с селекцией резистентной опухолевой популяции [43, 83, 94].

Предполагалось, что экспрессия гена MDR-1 влияет на развитие лекарственной устойчивости при БК ХМЛ in vivo [111]. Однако, например, Н.П.Логачева показала, что у 85 больных белок МЛУ обнаруживался в 30% случаев, при этом появление Pgp-позитивных клеток не всегда было связано с предшествующим лечением больных. По-видимому, в терминальной стадии ХМЛ резистентность к проводимой ПХТ в подавляющем большинстве случаев не связана с гиперэкспрессией Pgp [171].

По данным А.А.Ставровской, экспрессия Pgp позволяет прогнозировать более быстрое течение БК [173].

Роль Pgp в активном транспорте из BCR-ABL позитивных клеток ингибитора Abl-тирозинкиназы нуждается в дальнейшем изучении. В резистентных к STI571 клеточных линиях ХМЛ Ba/F3.p210 и К562 не обнаружено гиперэкспрессии протеинов MDR1 и MRP1 [152]. В противоположность этому, была обнаружена повышенная экспрессия Pgp в резистентной BCR-ABL позитивной клеточной линии [Mahon F.X et al., 91].

Необходимо отметить, что резистентность к цитостатическим препаратам является мультифакторной. Как правило, сложно выделить один ведущий механизм лекарственной устойчивости в опухоли. Этот факт, по-видимому, является причиной отсутствия клинически значимых результатов при попытках преодоления резистентности с помощью модуляторов, которые избирательно воздействуют лишь на определенный механизм лекарственной устойчивости.


1.3. ИССЛЕДОВАНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ К ЦИТОСТАТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ IN VITRO

Клеточная лекарственная устойчивость - одна их важных причин развития резистентности больных с гемобластозами к цитостатической терапии. В настоящее время разработаны методы количественной оценки данного типа лекарственной устойчивости in vitro на момент диагностики лейкоза и при его прогрессировании. С этой целью используются краткосрочные культуры «свежих» клеток крови и костного мозга больных.

1.3.1. Основные методы исследования лекарственной устойчивости in vitro.

Первое сообщение о тестировании лекарственной устойчивости in vitro и его корреляции с результатами терапии было опубликовано Black M.M. и Speer F.D. в 1954г. Авторы инкубировали «свежие» биопсийные образцы опухолей человека в присутствии цитостатических препаратов и с помощью спектрофотометра количественно измеряли степень повреждения клеток по уровню редукции тетразолия. Исследователи отметили сопоставимость между результатами тестов in vitro и ответом больных на химиотерапию [12]. В 1977г. Hamburger A.W. и Salmon S.E. сообщили данные, в которых оценивалась лекарственная чувствительность злокачественных клеток больных с помощью метода колониеобразования [122]. Колoниеобразующие исследования были признаны "золотым стандартом" для тестирования лекарственной устойчивости in vitro. Однако, данные методы использовались для определения резистентности преимущественно при высокоагрессивных опухолях с плохим прогнозом. К тому же длительность клоногенных исследований составляла не менее 2 недель [26, 126, 144]. Эти обстоятельства вызвали временное снижение интереса к колониеобразующим тестам лекарственной устойчивости in vitro.

Однако уже в 1978г. появились первые сообщения об использовании краткосрочного 4-дневного культурального метода DiSC (differential staining cytotoxicity) для исследования резистентности к цитостатическим препаратам в «свежих» опухолевых клетках больных [153]. Тест DiSC основан на различном окрашивании «живых» и погибших клеток определенным красителем вследствие неодинаковой структурной целостности мембран этих клеток. Данный метод позволяет определить количество погибших клеток после цитотоксического воздействия препаратов, а также вычислить долю нормальных клеток в популяции, переживающей лечение [9, 15]. Была показана одинаковая чувствительность бластных клеток крови и костного мозга к химиопрепаратам in vitro [10].

В 1983 г. Mossmann Т. опубликовал данные по использованию метода МТТ для определения резистентности опухолевых клеток in vitro [99]. Он заключается в колориметрическом количественном определении клеточной выживаемости, которое основано на расщеплении МТТ (соли тетразолия) митохондриальным ферментом сукцинатдегидрогеназой ‘живых’ клеток с образованием продукта - голубого формазана, определяемого с помощью спектрофотометра. В 1988 г. Pieters R. и соавт. адаптировали данный тест для оценки лекарственной устойчивости при детских острых лейкозах [107].

Таким образом, в настоящее время для исследования лекарственной устойчивости in vitro применяются два основных метода - DiSC и МТТ. В этих краткосрочных культуральных исследованиях анализируется ответ доминантной опухолевой популяции клеток без разграничения пролиферирующей и непролиферирующей фракций, независимо от механизма лекарственной устойчивости. Методы MTT и DiSC отражают конечный эффект цитотоксичности. Таким образом, краткосрочные культуральные исследования теоретически могут предсказывать клинический ответ [140, 142, 154].

Результаты DiSC- и МТТ-методов были сопоставимы с данными колониеобразующих исследований. Тесты DiSC и МТТ дают аналогичные результаты при наличии не менее 80% бластных клеток. Если их содержание меньше, то данные МТТ-анализа сильно искажаются ввиду присутствия нормальных клеток [11, 20, 155].


Общие ограничения методов исследования лекарственной устойчивости in vitro. Преимущества и недостатки тестов DiSC и МТТ.

Исследования лекарственной устойчивости in vitro имеют ряд ограничений, которые необходимо учитывать при интерпретации результатов. Условия исследования in vitro не могут полностью воспроизвести таковые in vivo, дозы для тестирования in vitro подбираются эмпирически. Максимальная концентрация цитостатического препарата in vitro считается стандартной и соответствующей максимальной сывороточной концентрации препарата in vivo после его введения в стандартных либо высоких дозах [57]. Не учитываются индивидуальные фармакокинетические особенности, что может обусловить несоответствие концентраций цитостатического препарата in vitro и in vivo. В многочисленных исследованиях показаны огромные индивидуальные различия летальных концентраций для опухолевых клеток у больных с одинаковыми нозологическими формами заболеваний [14, 106, 154]. Неэффективные вследствие неадекватной концентрации in vitro препараты могут в то же время оказывать активное действие in vivo и наоборот. Кроме того, резистентность in vitro, как правило, оценивается отдельно к каждому препарату (хотя возможно иследование их комбинаций), а в клинической практике используются многокомпонентные схемы терапии. Это обстоятельство также определяет относительную значимость результатов тестирования лекарственной устойчивости in vitro для клиники [2].

Тест DiSC позволяет исследовать лекарственную устойчивость в образцах, содержащих значительную примесь нормальных клеток, но не менее 30% бластов. Основными ограничениями метода являются его трудоемкость и субъективность, зависящая от квалификации персонала, производящего окраску мазков и подсчет клеток под микроскопом [154].

Тест МТТ в настоящее время получил широкое распространение в клинической практике, поскольку является полуавтоматическим, быстрым в исполнении, более дешевым, хорошо воспроизводимым. Однако на результаты теста сильно влияет присутствие даже небольшого количества нормальных клеток. Поэтому МТТ-метод используется только для исследования образцов, содержащих не менее 80% бластов [154]. Однако, в последние годы, если количество бластных клеток в крови или костном мозге недостаточно для МТТ-анализа, для выделения "чистой" опухолевой популяции при проведении теста применяется иммуномагнитная сепарация [131].

Техническая успешность методов исследования лекарственной устойчивости in vitro является высокой - удается оценить резистентность не менее чем в 90% образцов [57, 106, 154].

DiSC- и МТТ-методы могут считаться достаточно надежными, поскольку результаты исследования лекарственной резистентности in vitro коррелируют с клиническим ответом. Лечение цитостатическими препаратами, к которым наблюдалась устойчивость in vitro, в целом ряде наблюдений приводило к снижению процента клинических ответов [106, 123, 140, 154]. При исследовании опухолевых клеток больных, ранее получавших химиотерапию, по данным тестов DiSC и МТТ выявлено нарастание резистентности [8, 71, 108, 154]. Таким образом, профили лекарственной устойчивости у резистентных больных отражают ожидаемую клиническую картину. Опухолевые клетки этих пациентов могут служить клинической моделью для изучения приобретенной резистентности при лейкозах.

Области применения методов исследования лекарственной устойчивости in vitro включают [72]: 1) скрининг потенциально эффективных противоопухолевых препаратов; 2) изучение лекарственных взаимодействий (в т.ч. с модуляторами лекарственной устойчивости); 3) исследование перекрестной резистентности; 4) идентификацию больных из группы повышенного риска рецидива лейкоза; 5) индивидуальный подбор химиотерапии.

1.3.2. Прогностическое значение исследования лекарственной устойчивости in vitro при лейкозах

Многочисленные исследования, проведенные при различных гематологических заболеваниях, выявили, что результаты исследований лекарственной устойчивости in vitro могут частично объяснять биологические характеристики опухолей, и коррелировать с известными классическими прогностическими факторами [34, 69, 73, 102, 110, 131]. В нескольких наблюдениях было выявлено, что профили лекарственной устойчивости могут быть самостоятельными независимыми факторами, влияющими на прогноз [75, 101, 108, 129, 131]. Наиболее ярко прогностическая значимость тестов на лекарственную устойчивость in vitro представлена при острых лейкозах [57, 58, 70]. Результаты исследования лекарственной устойчивости при БК ХМЛ, как правило, включаются в анализ под рубрикой ОМЛ. Самостоятельные исследования по резистености in vitro при БК ХМЛ в литературе практически отсутствуют.
1.3.3. Индивидуализация химиотерапии по результатам исследований лекарственной устойчивости in vitro.

Впервые попытка сравнения эффективности стандартных эмпирических программ и химиотерапии, подобранной индивидуально по результатам тестов лекарственной устойчивости in vitro, предпринята в середине 1980-х гг. при множественной миеломе (Veteran Administration Cooperative Studies Group) и немелкоклеточном раке легкого (ECOG - Eastern Cooperative Oncology Group) [154]. В 1990г. von Hoff D.D. опубликовал результаты наблюдения у 55 больных с метастазирующим раком. Из 36 пациентов, получавших терапию по стандартному протоколу, частичный ответ был достигнут лишь у одного больного. В другой группе после применения индивидуально разработанной цитостатической терапии частичный ответ наблюдался у 4 из 19 пациентов. Различия оказались статистически достоверными (р=0,04), но выживаемость больных не увеличилась [145].

В 1992-1994 гг. в Голландии и Германии было проведено кооперированное исследование эффективности индивидуализации химиотерапии по тестам лекарственной устойчивости in vitro у 78 детей с резистентными формами и рецидивами ОЛЛ. 52 ребенка получали индивидуально подобранную химиотерапию, а 26 - стандартное в данных случаях лечение по протоколу BFM-REZ. Ответ в обеих группах оказался одинаковым и составил 44% и 46% соответственно. 2-летняя безрецидивная выживаемость в обеих группах составила 10%. Был сделан вывод, что индивидуальный подбор терапии по тестам лекарственной устойчивости in vitro не позволяет преодолеть лекарственную устойчивость в группе плохого прогноза детского ОЛЛ, и ,следовательно, не увеличивает частоту ответа и выживаемость по сравнению с общепринятыми протоколами [2].

Тем не менее, все авторы подчеркивают, что результаты исследования in vitro в группах плохого прогноза ОЛЛ и ОМЛ в известной степени отражают значительную резистентность больных in vivo и могут способствовать исключению из схем терапии потенциально неэффективных препаратов [2, 56, 57].

С другой стороны, хорошие результаты получены при исследовании лекарственной устойчивости при ХЛЛ. Оказалось, что чувствительность опухолевых лимфоцитов in vitro к флюдарабину при ХЛЛ является независимым прогностическим фактором в отношении выживаемости [16].
1.3.4. Исследование лекарственных взаимодействий ингибиторов тирозинкиназ с помощью тестов in vitro.

При бластном кризе хронического миелолейкоза результаты терапии ингибитором Abl-тирозинкиназы STI571 остаются неудовлетворительными [32, 124]. В связи с этим был проведен ряд исследований, целью которых явилось изучение активности данного препарата in vitro в сочетании с определенными цитостатическими средствами. В экспрессирующих BCR-ABL клеточных линиях BV173, EM-3 и К562 с помощью метода МТТ были выявлены 3 существенных факта. Во-первых, значительный синергизм комбинации STI571 с цитозаром, мафосфамидом и этопозидом в торможении опухолевой пролиферации. Во- вторых, оказалось, что гидроксимочевина, напротив, обладала умеренно выраженным антагонистическим эффектом в сочетании с STI571. И в третьих, ингибитор Abl-тирозинкиназы не оказывал антипролиферативного действия и не потенцировал эффекты цитостатических препаратов в BCR-ABL-негативных клеточных линиях KG1a и HL-60 [138]. В исследовании Druker B.J. et al. использовалась клеточная линия мегакариобластного лейкоза человека Mo7e, ее дериват Mo7р210, экспрессирующий BCR-ABL, и клеточная линия К562 [137]. Цитозар, даунорубицин и гидреа в МТТ-тесте тормозили опухолевый рост клеток линии Mo7e, в то время как STI571 не оказывал какого-либо влияния. В BCR-ABL-позитивных клеточных линиях Mo7р210 и К562 для проявления антипролиферативного эффекта требовались более высокие концентрации цитостатических препаратов, а в присутствии иматиниб мезилата авторы наблюдали значительное усиление противоопухолевого действия цитозара, даунорубицина и интерферона-α, но не гидроксимочевины. Был показан аддитивный антилейкемический эффект ингибитора Abl-тирозинкиназы в сочетании с интерфероном-α и даунорубицином in vitro. Комбинация иматиниб мезилата с цитозаром in vitro обладала выраженным синергизмом и оказывала максимальное ингибирующее действие на лейкозные клетки. Предполагаемый механизм усиления противоопухолевого действия иматиниб мезилата в сочетании с цитостатическими препаратами - усиление апоптоза, как за счет отмены активности BCR-ABL, так и при участии других механизмов.

Все вышеприведенные исследования служат основанием для проведения клинических испытаний эффективности комбинации ингибитора Abl-тирозинкиназы с цитозаром и антрациклинами у больных в терминальной стадии ХМЛ.
1.4. СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ТЕРАПИИ БЛАСТНОГО КРИЗА ХРОНИЧЕСКОГО МИЕЛОЛЕЙКОЗА

Лечение бластного криза хронического миелолейкоза представляет собой весьма сложную проблему. Результаты химиотерапии в этой фазе ХМЛ более чем скромные. Безуспешность лечения, по-видимому, обусловлена в значительной мере гетерогенностью лейкозной популяции и неодинаковой чувствительностью различных ее субклонов к современной химиотерапии. Тем не менее различными группами исследователей предпринимаются попытки улучшения результатов лечения бластного криза хронического миелолейкоза, целью которых является возврат в хроническую фазу заболевания и увеличение продолжительности жизни больных.

Попытка унифицировать критерии ответа на терапию при БК ХМЛ была предпринята исследователями из MDACC (M.D.Anderson Cancer Center) в 1987г. [67]. Критерии включали: 1)полный ответ – присутствие менее 5% бластов в костном мозге, отсутствие бластоза в крови, циркуляция более 1000 х 103 гранулоцитов и более 100.000 х 103 тромбоцитов в крови, длительность достигнутого ответа не менее 4 недель; 2) частичный ответ – наличие 6-25% бластов в костном мозге при нормальной периферической крови; 3) гематологическое улучшение – 5% и менее бластов в костном мозге при отсутствии нормализации периферической крови или нормальная гемограмма при бластозе более 25% в костном мозге; 4) отсутствие ответа.

Известно, что при лимфоидном варианте БК ХМЛ число полных и частичных ответов на полихимиотерапию, включающую преднизолон и винкристин, составляет 43-64%. Выживаемость больных при этом достоверно выше, чем у пациентов с нелимфоидным БК ХМЛ, получавших ПХТ [49, 67, 170].

За последние 5 лет наблюдается тенденция к интенсификации терапии нелимфоидных вариантов БК ХМЛ. При этом используются препараты, ранее не применявшиеся при данной нозологии.
Новые цитостатические препараты

В клиническом испытании I фазы Tamura K. et al. 32 больным с резистентными формами или рецидивом ОМЛ и БК ХМЛ применяли идарубицин в виде монотерапии в течение 3 дней в дозе 10-15 мг/м2, при этом общий ответ на лечение составил 27%, переносимость была хорошей [132].

В MDACC предпринято исследование эффективности нового препарата – децитабина в терминальной стадии ХМЛ. Децитабин – 5-аза-2’-деоксицитидин – гипометилирующий агент. Kantarjian H.M., Talpaz M., O’Brien S. et al. применяли препарат у 37 больных (из них у 20 с БК ХМЛ, у 17 с ФА ХМЛ) с медианой возраста 52 года. 13 больных получали децитабин в дозе 100 мг/м2 в течение 6 ч х 2 раза в день в течение 5 дней; 24 пациента получили децитабин в дозе 75 мг/м2 в течение 6 ч 2 раза в день в течение 5 дней. При БК ХМЛ 2 больных (10%) достигли полного ответа и у 3 (15%) наблюдалось гематологическое улучшение. Общий ответ составил 25%. В фазе акселерации уровень общего ответа был выше и составил 53%. Продолжительность достигнутого результата не указывается. Наиболее значимым побочным эффектом была длительная миелосупрессия с восстановлением уровня гранулоцитов в крови более 500 клеток в среднем на 48 день перерыва после курса и восстановлением уровня тромбоцитов в крови выше 30 тыс. – на 31 день. Фебрильная лихорадка отмечалась у 25 (68%) больных. Был сделан вывод об определенной эффективности децитабина при ХМЛ [68].

Для оценки эффективности монотерапии карбоплатином в терминальной стадии ХМЛ проведено испытание II фазы ECOG. Dutcher J.P., Wiernik P.H. et al. применяли карбоплатин в дозе 250 мг/м2 в виде постоянной инфузии в течение 5 дней, максимально – 3 курса. Общий ответ у 36 больных составил 22%, из них у 13,9% - полный. Средняя длительность достигнутого ответа – 3 мес. (1.4-8.94 мес.), медиана выживаемости общая 3.5 мес. (2.4-11.4 мес.), медиана выживаемости ответивших – 12.8 мес. (3.6-17.2 мес.). Трое больных пережили 2, 2.5 и 3.5 лет [33].

В литературе имеются сообщения об эффективности алкилирующего химиопрепарата тиофосфамида при ХМЛ как в хронической [118], так и в терминальных стадиях. Французские исследователи Kone M., Dupont C. et al. оценили эффективность тиофосфамида в сочетании с вепезидом у 14 больных ХМЛ с медианой возраста 51 год (11 - БК, 3 - ФА). Тиофосфамид в дозе 75 мг/м2 и вепезид (этопофос - модифицированная форма для болюсных инъекций) в дозе 100 мг/м2 вводили 1 раз в 2 недели. Для получения ответа необходимо было в среднем 7 введений препаратов. В фазе акселерации у всех больных получена вторая хроническая фаза, а у 1 пациента - полная клинико-гематологическая ремиссия. Средняя продолжительность достигнутого результата составила 14,3 мес. (4-21). Вторая хроническая фаза также была получена у 4 из 11 больных с БК ХМЛ, средняя продолжительность ее составила 12,3 мес. (9-14). Лечение проводилось амбулаторно. Авторы делают вывод, что этот режим может быть альтернативой для больных в терминальной стадии ХМЛ, которым невозможно проводить патогенетическую терапию [77].

Интенсификация полихимиотерапии

Montefusco E., Petti M.C. et al. провели II фазу клинических испытаний с 1992 по 1996гг. 17 больных с нелимфоидным БК ХМЛ (средний возраст 33 года, 10-45лет) получали химиотерапию по программе VAC: вепезид 100 мг/м2 в 1-3 и 8-10 дни, цитозар 500 мг/м2 2 раза в день в те же дни и карбоплатин 150 мг/м2 в виде постоянной инфузии в те же дни. Программа рассчитана на преодоление кинетической резистентности по принципу "двойной индукции": второй курс ПХТ проводился в период начинающейся регенерации костного мозга после мощного цитостатического воздействия в период максимальной концентрации эндогенных факторов роста. Существовала возможность выхода в пролиферацию "покоящихся" лейкозных клеток [18, 141]. Полный ответ был достигнут у 11 больных (65%), при этом у 7 из них (64%) наблюдался и цитогенетический ответ c cодержанием 38-100% Ph’-негативных метафаз. Из 6 неответивших пациентов 3 умерли от сепсиса в фазе индукции, и 3 были резистентны. Один больной погиб в полной ремиссии при явлениях гемоторакса. У всех лиц после курса наблюдалась глубокая миелосупрессия, у 29.5% - мукозит, соответствующий III степени токсичности, и у 29.5% - дисфункция печени. Явлений нефрологической токсичности не наблюдалось. На момент окончания исследования 4 больных были живы, из них 3 – во второй ХФ длительностью 7, 10 и 16 мес и 1 – во втором БК с общей выживаемостью 38 мес. Авторы отмечают, что указанная комбинация химиопрепаратов обладает значительным противоопухолевым эффектом, хотя безрецидивная выживаемость больных остается короткой [98].

В MDACC проведено исследование I фазы программы FLAM в качестве терапии «отчаяния». Этот режим ХТ включал флюдарабин 30 мг/м2 в 1-5 дни, цитозар 2 г/м2 в 1-5 дни, митоксантрон в дозах, превышающих стандартные (суммарная доза максимально до 60 мг/м2 в течение 4 дней). Данный режим обоснован синергизмом противоопухолевого действия препаратов. В исследование включены 55 больных; полный ответ был достигнут у 27.3% (4/17 – резистентный/рецидив ОМЛ, 4/12 - резистентный/рецидив ОЛЛ, 7/26 – БК ХМЛ). Средняя длительность достигнутого ответа составила 42 дня. Из осложнений отмечены миелосупрессия, обратимая гипербилирубинемия. Неблагоприятными факторами для ответа на терапию были плохой общий статус пациентов до начала лечения и недифференцированный варинт БК ХМЛ [76].

У 15 больных БК ХМЛ проводился курс ПХТ по программе FLAG, включающей флюдарабин, высокие дозы цитозара и Г-КСФ. При достижении ремиссии больные получали еще 2 дополнительных аналогичных курса. Ответ был достигнут у 7 пациентов (46,7%), первичная резистентность наблюдалась у 3 больных (20%). 3 пациента (20%) умерли во время проведения индукционной терапии. Консолидация ремиссии предпринята у 5 из 7 больных, у 2 - она была невозможна из-за токсических осложнений. Медиана безрецидивной выживаемости составила 4,5 мес., общей выживаемости - 7,5 мес. Таким образом, высокодозная терапия по программе FLAG реально не улучшила выживаемость больных [133].

Терапия высокими дозами цитозара в сочетании с идарубицином (цитозар 1,5-3 г/м2 каждые 12 часов в течение 6 дней; идарубицин 12 мг/м2 3 дня) также не оказала существенного влияния на выживаемость 16 пациентов с миелоидным вариантом БК ХМЛ, полная клинико-гематологическая ремиссия получена лишь у 1 больного [4].

В MDACC сравнивалась эффективность различных режимов терапии при БК ХМЛ у 162 больных, находившихся на лечении в данном центре в период с 1986 по 1997гг. Анализировалась только эффективность терапии I линии. 90 больных получали интенсивную химиотерапию (FLAM, высокие дозы цитозара с митоксантроном), 31 больной – монотерапию децитабином, 41 больной – монохимиотерапию другими препаратами (6-МП, гидроксимочевина). Общий положительный ответ составил 22% (36 больных), при этом процент ответивших был примерно одинаков в группе интенсивной химиотерапии (28%) и в группе, получавшей децитабин (26%). В третьей группе положительный ответ составил 7%. Средняя длительность достигнутого результата составила 29 нед, общая медиана выживаемости – 22 нед. При оценке по группам медиана выживаемости составила 21 нед. в 1-й группе, 29 нед. – во 2-й и 22 нед. – в 3-й. Для больных старшей возрастной группы наилучшие результаты были получены на терапии децитабином. Во всех группах наблюдавшихся больных основным побочным эффектом была миелосупрессия. У 20% больных, получавших интенсивную ПХТ, наблюдалась негематологическая токсичность [121].

Таким образом, по данным литературы интенсификация лечения и включение новых цитостатических препаратов при нелимфоидном БК ХМЛ позволяет достичь ответа в среднем у 22-28% больных, при этом длительность ответа составляет 3-6 мес. Медиана выживаемости больных при отсутствии ответа составляет около 4 мес., у ответивших – несколько выше (до 13 мес.).
Патогенетическая терапия БК ХМЛ

В 1998г. была проведена I фаза клинических испытаний ингибитора Abl-тирозинкиназы STI571 (Гливек, иматиниб мезилат) при бластном кризе хронического миелолейкоза [Druker B.J., Sawyers C.L., Kantarjian H.M. et al., 32]. В критерии ответа на лечение были включены: 1) полный гематологический ответ - аналогичный критериям MDACC 1987г.; 2) костномозговой ответ - бластоз менее 15% в костном мозге при отсутствии нормализации количества тромбоцитов и гранулоцитов в крови. Больные, не соответствующие этим критериям, считались «неответившими». Рецидив определялся в случае появления бластных клеток в крови и/или костном мозге после достижения ответа. Время до развития рецидива исчислялось от момента начала приема иматиниба. В понятие прогрессии заболевания вошли: 1) увеличение количества бластов в костном мозге более 15%; 2) появление более 5% бластов в крови; 3) нарастание лейкоцитоза более 20.000 х 109/л. Больные получали препарат в дозе 300-1000 мг/сут.

При нелимфоидном бластном кризе положительный ответ был получен у 21 из 38 больных (55%), при этом у 17 больных (45%) отмечалось снижение бластоза менее чем до 5% в костном мозге, а у 4 пациентов (11%) - полная клинико-гематологическая ремиссия. Как правило, у больных, отвечающих на лечение, значительное уменьшение бластоза в крови и костном мозге происходило в течение 1-й недели терапии. Однако у 9 больных впоследствии наступил рецидив с медианой продолжительности ответа 84 дня (42-194). Еще 5 пациентов были исключены из исследования: одному больному была проведена трансплантация аллогенных стволовых клеток, у одного пациента наблюдалась плохая переносимость лечения. У 3-х отмечены серьезные побочные явления. У 7 больных, остававшихся в ремиссии, период наблюдения составил 101-349 дней.

При лимфоидном бластном кризе 14 из 20 больных ответили на терапию (70%). Однако у 12 из 14 пациентов быстро развился рецидив заболевания с медианой продолжительности ответа 58 дней (42-123). У 1 больного был недостаточно продолжительный период наблюдения, и 1 пациенту выполнена трансплантация аллогенных стволовых клеток.

Все больные, у которых развился рецидив, были Ph’-позитивными. Большой цитогенетический ответ (БЦО) наблюдался у 7 из 58 больных с гематологическим ответом (12%). При этом у 5 пациентов был полный цитогенетический ответ (ПЦО) (3 больных с миелоидным, 2 - с лимфоидным вариантом заболевания).

В связи с быстрым развитием рецидивов на монотерапии при лимфоидном бластном кризе хронического миелолейкоза в большинство последующих протоколов вошли пациенты с нелимфоидным вариантом.

В исследование II фазы были включены 260 больных с миелоидным БК ХМЛ из 27 центров в 6 странах мира (США, Швейцария, Германия, Великобритания, Франция, Италия [55, 125]. 95 больных были “предлеченными”, 195 пациентов ранее не получали терапию по поводу БК. Гематологический ответ достигнут у 135 больных (52%). Однако, он сохранялся более 4 недель лишь у 31% пациентов (80 человек). Среди этих больных полная клинико-гематологическая ремиссия наблюдалась у 8% (21 пациент). У ответивших на лечение медиана продолжительности ответа составила 10 месяцев. У 36% больных наблюдался цитогенетический ответ. При этом полный цитогенетический ответ (ПЦО) отмечен у 7% (18 больных), большой цитогенетичский ответ (БЦО) - у 16% (42 больных). Общая медиана продолжительности ответа составила 6,6 мес. Медиана выживаемости у «непредлеченных» больных составила 7,1 мес., у больных, ранее получавших химиотерапию- 5,2 мес., общая – 6,9 мес.

Благоприятными прогностическими факторами для достижения гематологического ответа были следующие критерии: возраст моложе 60 лет, гемоглобин более 100 г/л, бластоз в периферической крови менее 50%, колтчество тромбоцитов выше 100.000 х 109/л. Значимым прогностическим фактором для выживаемости был сохраняющийся в течение 3 месяцев гематологический ответ.

Явления негематологической токсичности отмечались достаточно часто и включали тошноту, отеки, рвоту, мышечные боли, диаррею и дерматит. Эти побочные эффекты были, как правило, умеренно выраженными и редко требовали прекращения терапии. Гематологическая токсичность - тромбоцитопения III-IV степени отмечалась у 62% больных; гранулоцитопения III-IV степени - у 58% пациентов. Прекращение терапии вследствие развития побочных эффектов потребовалось у 5% больных.

Goldman J.M. с соавт. [92] приводят собственные данные о лечении иматиниб мезилатом 20 больных с нелимфоидным бластным кризом ХМЛ. Медиана между диагностикой бластного криза и началом терапии составила 2 мес. (3 дня-12 мес.). Медиана наблюдения после начала приема STI571 - 159 дней (70-250), медиана выживаемости - 170 дней (123-217 дней). Вероятность выживаемости на 250 день составила 25%. У 9 больных (45%) был получен цитогенетический ответ, который определялся как любое снижение количества Ph-позитивных метафаз в костном мозге. У 1 из 9 вышеупомянутых больных наблюдался полный цитогенетический ответ. При анализе прогностических факторов, влияющих на выживаемость, оказалось, что 250 день от начала терапии при отсутствии цитогенетического ответа не пережил ни один пациент, в то время как 50% больных из группы достигших любого цитогенетического ответа продолжали жить 250 и более дней..

У 53 больных с нелимфоидным бластным кризом ХМЛ Lahaye T., Hochhaus A. et al. [80] оценили прогностическую значимость иммунофенотипа и дополнительных цитогенетических аномалий для ответа на терапию иматинибом. Различия оказались недостоверными, но 25 больных, у которых бластные клетки несли только миелоидные маркеры, имели медиану выживаемости 132 дня, при наличии дополнительных лимфоидных антигенов у 4 пациентов медиана выживаемости составила 275 дней, а при коэкспрессии монобластных маркеров у 3 больных - 262 дня. Пациенты, не имеющие дополнительных хромосомный аберраций (11 человек), имели медиану выживаемости 262 дня, при наличии трисомии 8 - 120 дней (7 больных), в присутствии второй Ph-хромосомы - 119 дней (4 пациента), в случае аномалий хромосомы 17 - 115 дней (8 больных).

По данным MDACC [66] монотерапия иматиниб мезилатом позволила достичь гематологического ответа у 52% из 75 пациентов с бластным кризом хронического миелолейкоза (65 – с НБК, 10 – с ЛБК), ЦГО – у 16%. Выживаемость к 12 месяцам лечения составила 22%. Прогностическим фактором, влияющим на выживаемость, оказался сохраняющийся на 8 неделе лечения гематологический ответ. При сравнении с результатами ПХТ отмечены значительно меньшая токсичность иматиниб мезилата, достоверно больший процент гематологических ответов (29% и 55 % соответственно, p=0,001), увеличение выживаемости (p=0,04), и снижение летальности в период индукционной терапии (различие недостоверно).

Таким образом, с помощью патогенетической терапии бластного криза хронического миелолейкоза удается достичь высокого процента ответов в период терапии индукции. Однако при лимфоидном варианте заболевания уже через 2-4 месяца наблюдались рецидивы у 100% пациентов. Результаты лечения больных с нелимфоидным вариантом бластного криза несколько лучше, около одной трети пациентов переживали 1 год. Дальнейшие усилия клиницистов будут направлены на поиск эффективных комбинаций иматиниб мезилата с цитостатическими препаратами, для которых показан синергизм in vitro.

Нам представляется важным разработка оптимальных терапевтических режимов даже в стадии бластного криза ХМЛ, поскольку он является неизбежным этапом течения болезни. Возможно, что лекарственные исследования чувствительности in vitro помогут в решении этой задачи, поскольку ранее такие исследования при БК ХМЛ не проводились.




следующая страница >>